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25 000 Euro gehen an Forscher aus Tübingen
Forschungspreis des Landes 2011: Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch
Heute verlieh Alexander Bonde, Minister für Ländlichen Raum und Verbraucherschutz in Baden-Württemberg, den Forschungspreis "Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch" in Stuttgart. Der mit 25.000 Euro dotierte Preis ging an Dr. Martina Berger sowie an Martina Zimmermann und Prof. Dr. Ulrich Lauer vom Universitätsklinikum Tübingen für folgende Forschungsarbeiten:
zur Pressemeldung des Landes Baden-Württemberg
Obwohl eine Vielzahl an Therapiestrategien zur Behandlung von Krebs vorhanden sind, gab es im Jahre 2008 weltweit immer noch 12,7 Millionen gemeldete Krebserkrankungen und 7,6 Millionen Patienten, die an den Folgen einer Krebserkrankung gestorben sind [1]. Daher gibt es einen großen Bedarf an der Erforschung und Entwicklung neuartiger Krebstherapeutika. Bevor aber solche neuen Medikamente zugelassen und Krebspatien-ten zur Verfügung gestellt werden können, müssen umfangreiche Untersuchungen durchgeführt werden.
Dieses geschieht üblicherweise anhand von menschlichen Tumor-Zelllinien oder Tiermo-dellen, bei denen menschliche Tumorzellen unter der Haut von Mäusen anwachsen (Xenograft Modell), was aber im Vergleich zur realen Situation der Tumorbiologie im Patien-ten als hochgradigkünstlich anzusehen ist[2].
Eine Ergänzung zu den Standard-Untersuchungen an Tumorzelllinien und Xenograft-Tumor-Tiermodellen bietet daher die Gewebekultur von dünnen Gewebeschnitten aus menschlichen Organen, in denen Krebszellen entstanden sind bzw. sich als Absiedelun-gen/Metastasen angesiedelt haben.
Bisher wurde diese sog. Precision-Cut Liver Slice Technologie (PCLS) hauptsächlich an Organen ohne Krebsbesiedelung verwendet und stellt eine anerkannte Methode vor allem zur Evaluierung pharmakologisch wirksamer Substanzen dar [3-5]. Die Besonderheit der Methode liegt darin, dass Gewebeschnitte nicht nur aus gesundem menschlichen Gewebe angefertigt werde können, sondern auch aus menschlichem Tumormaterial, das die gesamte dreidimensionale Vielfältigkeit eines natürlich entstandenen und ausgewachsenen Tumors beinhaltet. So können Untersuchungen durchgeführt werden, die der "wahren" Situation bei Tumorpatienten wesentlich näher sind, als dies bei der Verwen-dung von künstlich erzeugten menschlichen Tumoren in Mäusen der Fall ist.
Damit zukünftig überflüssige oder gar sinnlose Tierexperimente vermieden und darüber hinaus auch aussagekräftige, weil patientennahe Untersuchungen durchgeführt werden können, haben M. Zimmermann und Prof. U. M. Lauer an einer umfassenden Etablierung eines Testsystems im Speziellen für onkolytische Viren anhand von menschlichen Gewebeproben gearbeitet.
Onkolytische Viren stellen eine neuartige Behandlungsform von Krebs dar (sog. Virotherapie). Diese Viren haben die Fähigkeit, gezielt Tumorzellen zu infizieren und diese dadurch zu zerstören. Es stellt allerdings eine besondere Herausforderung dar, Viren zu identifizieren, die nur Tumoren und möglichst wenig bzw. gar keine Normalzellen infizie-ren. Besonders bei Viren, die nur menschliche Zellen infizieren (z.B. von humanpathogenen Masern-Viren abgeleitete Impfviren; MeV),ergibt sich die folgende Problematik: im Mausmodell kann zwar untersucht werden, ob der künstlich eingepflanzte menschliche Tumor durch die Behandlung mit onkolytischen Masern-Impfviren kleiner wird, aber es kann nicht untersucht werden, inwiefern möglicherweise auch gesunde Zellen infiziert werden und es dabei ggf. zu einer Schädigung von Organen kommen könnte, da Mauszellen nicht von dem Virus befallen werden können.
Um das Potential bzw. vor allem die Tumor-Selektivität onkolytischer Viren, wie z.B. Masern-Impfviren, im menschlichen Kontext genauer untersuchen zu können, hat M. Zimmermann unter der Leitung von Prof. Lauer aus menschlicher Leber und Krebs-Arealen in der Leber sehr dünne Gewebeschnitte (Precision-Cut Liver Slices: PCLS) angefertigt[6]. Diese 200 μm dünnen Gewebeschnitte mit einem Durchmesser von 8 mm wurden unter speziellen Bedingungen kultiviert und mit onkolytischen Masern-Impfviren infiziert.
Anhand exemplarischer Gewebeschnitte, die aus dem Leber-/Tumor- Übergangsbereich hergestellt wurden und dementsprechend sowohl Leber- als auch Tumorgewebe beinhal-ten, konnte gezeigt werden, dass Masern-Impfviren bevorzugt das Tumorgewebe und nicht das umliegende menschliche Lebergewebe infiziert haben. Außerdem konnte mit modernster Mikroskopie-Technologie(sog. konfokale Laserscanning Mikroskopie) nachgewiesen werden, dass nicht nur die Oberfläche der Gewebeschnitte infiziert war, sondern dass die Viren auch in den inneren Bereich des Gewebes vorgedrungen waren[6].
Für die Anwendung von onkolytischen Masern-Impfviren im Patienten bedeutet dies, dass möglicherweise schon eine geringe Dosis des Virus den Tumor von innen heraus bekämpfen kann, weil sich die Infektion tief in den Tumor "hineinfrisst", ohne dass dabei gesunde umliegende Gewebe großartig mit geschädigt werden. So bietet die Untersuchung anhand von menschlichem Resektionsmaterial eine einzigartige Erweiterung des Erkenntnisgewinns im Vorfeld klinischer Studien.
Durch die Verwendung eines neuartigen, digitalen Schneidegerätes zur Anfertigung von humanen Gewebeschnitten konnte der für die Qualität der Tissue slicesso wichtige Schneideprozess in der Arbeitsgruppe von Prof. Lauer durch aufwändige Untersuchungen von M. Zimmermann und Kollegen zusätzlich optimiert werden (besonderer Dank gilt hierbei Johanna Lampe, Sebastian Lange und Irina Smirnow)[7, 8].
Darüber hinaus konnte in einer Kooperationsarbeit mit Dr. M. Mühlebach vom Paul-Ehrlich-Institut in Langen durch das Sammeln von Kulturüberständen von humanen Tumor- bzw. Lebergewebeschnitten erstmalig systematisch gezeigt werden, dass bestimm-te Enzyme (Metalloproteinasen) vermehrt in Tumoren gebildet werden[9]. Spezielle, künstlich veränderte onkolytische Masern-Impfviren können sich nur in Anwesenheit dieser Enzyme ausbreiten und sind daher auf den Tumor beschränkt. Dies konnte anhand von Gewebeschnitten aus menschlicher Leber gezeigt werden, wobei sich die veränderten Masern-Impfviren im Gegensatz zu den unveränderten Masern-Impfviren, bei denen es vereinzelt zu einer Infektion des Lebergewebes kommen kann, nicht mehr in gesunder Leber ausbreiten konnten, was einen wichtigen Sicherheitsmechanismus darstellt[9].
Neben der Verwendung der PCLS-Methode zur Untersuchung von onkolytischen Viren sind in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Lauer zwei weitere hochrangige Arbeiten auf dem Gebiet der Krebsforschung entstanden, die durch die etablierte PCLS-Gewebekultur stark aufgewertet worden sind [10, 11].
Die Arbeiten von M. Zimmermann und U.M. Lauer stoßen auf ein breites internationales Interesse und führten einerseits zu einer Einladung, ein entsprechendes Buchkapitel zu verfassen (Human Cell Culture Protocols, Springer Verlag, PreclinicalTestingof Virotherapeutics for Primary and Secondary Tumors of the Liver. Erscheinungsdatum 28.12.2011) und außerdem zu der Bitte, die PCLS Methode z.B. in einer US amerikani-schen Firma (Genelux Corporation, San Diego, Kalifornien) zu etablieren.
Somit konnte auf der Grundlage der umfangreichen Arbeiten in der onkologischen For-schung durch M. Zimmermann und U.M. Lauer ein sehr hoher Verbreitungsgrad dieser PCLS Methodik mit menschlichen Gewebeproben im Sinne des Tierversuchs-Replacements erzielt werden.
Die Etablierung der PCLS Methode am Forschungsstandort Tübingen und an weiteren nationalen und internationalen Standorten bietet somit eine qualitativ hohe patientennahe Ergänzung oder möglicherweise sogar einen Ersatz von Tierexperimenten und liefert wichtige präklinische Daten, nicht nur im Hinblick auf Zulassungsarbeiten für neuartige Krebstherapeutika.
Im Idealfall soll diese Methode in der Perspektive zu einer Patienten-individualisierten prätherapeutischen Analyse eingesetzt werden. Auf diese Weise könnte bereits vor je-dem Einsatz von Krebsmedikamenten spezifisch geprüft werden, (i) ob der jeweilige Patient auf diese Wirkstoffe anspricht und (ii) inwiefern möglicherweise mit schwerwiegenden hepatotoxischen Nebenwirkungen zu rechnen ist. Dies würde die bis heute im wesentlichen gültige "Gleichbehandlung" von Krebspatienten durch eine gezielte Auswahl von Krebstherapeutika ablösen, bei denen aufgrund der Vortestung an patienteneigenen Tumorgeweben mit hoher Trennschärfe die Wirksamkeit von Krebstherapeutika vorausgesagt werden kann, was die Wirksamkeit verbessert und insbesondere auch Nebenwirkungen ohne Behandlungseffekt vermeiden helfen wird.
Zusammenfassend wird durch die Etablierung der PLCS-Technologie im Kontext von virotherapeutischen / hepatotoxischen Fragestellungen die Aussagekraft präklinischer Forschungsergebnisse signifikant verbessert (Refinement, Tierversuchs-Replacement) und
dadurch eine Einsparung von Tierversuchsumfängen (im Sinne einer Tierversuchs-Reduction) ermöglicht.
Referenzen zu der Preisarbeit:
1. Jemal, A., et al., Global cancer statistics. CA: a cancer journal for clinicians, 2011. 61(2): p. 69-90.
2. Frese, K.K. and D.A. Tuveson, Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Can-cer, 2007. 7(9): p. 645-58.
3. Parrish, A.R., A.J. Gandolfi, and K. Brendel, Precision-cut tissue slices: applicati-ons in pharmacology and toxicology. Life Sci, 1995. 57(21): p. 1887-901.
4. Olinga, P., et al., Liver slices in in vitro pharmacotoxicology with special reference to the use of human liver tissue. Toxicol In Vitro, 1997. 12(1): p. 77-100.
5. de Graaf, I.A., et al., Preparation and incubation of precision-cut liver and intesti-nal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nat Protoc, 2010. 5(9): p. 1540-51.
6. Zimmermann, M., et al., Human precision-cut liver tumor slices as a tumor pati-ent-individual predictive test system for oncolytic measles vaccine viruses. Int J Oncol, 2009. 34(5): p. 1247-56.
7. Zimmermann, M., et al., Precision-Cut Slices of Normal and Tumorous Liver Tis-sues Generated with the Leica VT1200 S Vibrating Blade Microtome, 2009, Leica Microsystems
8. Zimmermann, M., et al., Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology, 2009. 61(3): p. 145-152.
9. Mühlebach, M.D., et al., Liver cancer protease acticity profiles support therapeu-tic options with MMP activatable oncolytic measles virus. Cancer Reseach, 2010. 70(19): p. 7620-7629.
10. Venturelli, S., et al., Dual antitumour effect of 5-azacytidine by inducing a break-down of resistance-mediating factors and epigenetic modulation. Gut, 2011. 60(2): p. 156-65.
11. Weiland T, et al., Specific therapeutic targeting of primary malignancies of the human liver enabled by controlled depletion of adenosine triphosphate. submitted 2011.
Kontakt:
und
Testsystem für biologische Ersatzherzklappen zur Simulation von physiologischen Bedingungen als Ersatz von und Ergänzung zu Tierversuchen
Biologische Herzklappenprothesen, die entweder aus Herzklappen vom Schwein oder aus den Herzbeuteln vom Rind hergestellt werden, besitzen eine auf ca. 12 bis 18 Jahre begrenzte Lebensdauer, da es im Laufe der Zeit zu Degenerationserscheinungen durch Kalkablagerungen kommt. Die Methode der Wahl um Untersuchungen zu den Hintergründen und zur Verminderung von solchen Degenerationserscheinungen unter physiologischen Bedingungen, das heißt Bedingungen wie nach der Implantation ins Herz, zu erhalten, ist zurzeit die Implantation der Herzklappen in ein Großtiermodell. Als Tier wird meist das Schaf eingesetzt, da die hier implantierten Herzklappen sehr ähnlich den klinisch beobachteten Klappen verkalken, der Prozess aber wesentlich beschleunigt abläuft.
Zur Reduktion der Anzahl an Großtierstudien wurde in dieser Arbeit ein Realtime-Herzklappen-Bioreaktor entwickelt. Das heißt ein Testsystem, in das die zu testenden Herzklappenprothesen eingesetzt werden können und in dem dann der Blutfluss, der Blutdruck, das Druckprofil, die Herzfrequenz, die Temperatur und die Viskosität von Blut simuliert werden so wie diese Parameter auch im menschlichen Herz auftreten. Die Fre-quenz kann zwischen 0,25 und 3 Hz betragen und der Druck bis auf 180/100 mmHg erhöht werden. Langzeituntersuchungen können an acht Herzklappen parallel durchgeführt werden.
Mit diesem System können viele Versuchsparameter schon vorab untersucht werden, für die sonst schon ein Tierversuch notwendig wäre. Zudem können während des Versuches durch die Zugänglichkeit der Herzklappen zusätzliche Parameter beobachtet werden.
Das Gefäß ist aus Glas und die Herzklappen können während des Versuchs über eine high-speed Kamera analysiert werden. Gleichzeitig können während des Versuches Proben genommen werden. Außerdem ist es möglich im Bioreaktorsystem mit humanem Material, zum Beispiel humanem Blut, zu arbeiten, was einen weiteren Vorteil zum Tierversuch darstellt.
Ein wichtiger Einsatzbereich ist die einfache Simulierung von Bluthochdruck im Bioreaktorsystem. Diese Versuche sind im Großtiermodell äußerst schwierig, da künstlich hohe Blutdrücke in den Tieren ausgelöst werden müssen. Dies führt schon vor den eigentlichen Versuchen zu einer erhöhten Sterblichkeit der Tiere.
Kontakt:
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